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 三氯蔗糖的合成路線大體可分為3類：單酯法、化學一酶法和基團遷移法。化學一酶法6位基團保護法該法是Tate-Lyle公司開發的。首先利用芽孢桿菌屬的菌株在30℃下發酵葡萄糖，生成葡萄糖-6-乙酸，葡萄糖-6-乙酸的最高濃度可達15g/L，收率可達理論收率的85%。然后采用抽提及硅膠柱層析分離相結合的方法提純葡萄糖-6-乙酸，提純收率為80%～85%。在由枯草桿菌產生的β-果糖基轉移酶的作用下，葡萄糖-6-乙酸與蔗糖混合反應生成蔗糖-6-乙酸，蔗糖-6-乙酸的濃度可達120g/L，該步收率為58%。采用層析的方法可分離得到7Chemicalbook0%純度的蔗糖-6-乙酸。蔗糖-6-乙酸與由和DMF制成的Vilsmeier試劑反應，即可得到4，1’，6’，-三氯-4，1’，6’-三脫氧半乳蔗糖五乙酸，該步收率為39%。三氯蔗糖五乙酸脫去乙酸基后即得三氯蔗糖，脫乙酸的收率為90%。該法中葡萄糖-6-乙酸的發酵代價較高，蔗糖-6-乙酸的提純較困難，總收率約20%。合成路線如下：以棉子糖為原料合成該法也是Tate-Lyle公司開發的。棉子糖甜菜和棉子等植物中，目前尚無大量商品供應，可由半乳糖和蔗糖的飽和溶液在30℃、鏟半乳糖苷酶的作用下合成，產物濃度可達7.5g/L。